利用分子標記輔助育種技術選育低溫高產草菇菌株
趙妍1*，顏素雅1*，林鋒1，余昌霞1，蔣俊2，陳明杰1**，宋曉霞1**
（1.國家食用菌工程技術研究中心,上海市農業科學院食用菌研究所；2.麗水市農業科學研究院食藥用菌研究所）
分子植物育種 2017年第8期
草菇是一種喜溫、喜濕，自然條件下生長在稻草上的腐生型真菌，故得名。草菇在分類學上屬于真菌界(Fungi)、擔子菌門(Basidiomycota)、傘菌綱(Agaricomycetes)、傘菌目(Agaricales)、光柄菇科(Pluteaceae)、小包腳菇屬(Volvariella)(張樹庭,1975)。在中國，草菇已經有三百多年的栽培歷史，種植區域主要分布在廣東、廣西、福建、臺灣、海南等地區(Chang,1977)。與其它人工栽培的食用菌相比，草菇的生物轉化率極低，一般僅有20%左右，草菇菌絲生長的最適溫度范圍為32～35℃，當溫度低于15℃或高于42℃時，菌絲生長緩慢，溫度低于10℃時菌絲停止生長。子實體分化發育的最適溫度范圍為27～31℃，23℃以下難以形成子實體(鄧優錦等,2011)。草菇對高溫的要求使得在自然條件下草菇的生產局限在中國少數幾個省份，再加上采收時氣溫高，又不能低溫貯藏，嚴重制約了草菇的生產與流通。多年來，許多學者致力于草菇保鮮技術的研究，孫育紅等(2010)發明的氣調包裝盒，可使草菇在12℃下保存96h以上，最長可達120h；葉蕙等(2000)用0.8kGy的60Co-γ處理可使草菇貯藏期延長至6d。但由于這些方法成本較高，加上各地物流水平的差異，使得草菇的流通出現種種局限。因此要想從根本上解決上述問題，需要培育出適合當地生產的耐低溫且高產的草菇新品種。
食用菌的育種方法主要有自然選育、誘變育種、雜交育種、原生質體融合育種等(陳恒雷和曾憲賢2005;林鋒等,2014)。其中雜交育種由于其操作簡單，預見性強而被廣泛使用，但由于草菇屬于同宗結合的真菌，其菌絲多核且沒有鎖狀聯合(ChangandYau,1971)，雜交種的鑒定缺乏切實可行的方法(謝寶貴等,2001)，致使草菇雜交選育難以進行。近年來，分子標記技術在草菇育種領域逐漸被應用，如陳劍等(2011)利用RAPD技術對草菇雜交后代及其親本進行鑒定，成功鑒定出雜交產物；傅俊生等(2010a)利用SCAR標記對雜種進行鑒定以及雜種后代單孢分離產物分析，這些分子標記技術的應用解決了草菇雜交育種過程中因菌絲細胞多核且無鎖狀聯合而缺乏有效鑒定雜交后代的難題，使得雜交育種在草菇育種中的作用越來越重要。
本研究首先借助RAPD分子標記技術對11個草菇菌株進行了遺傳差異分析，發現VH3和泰國No.1菌株遺傳距離較大，親緣關系較遠。因此我們將低溫菌株VH3和與其親緣關系較遠的泰國No.1菌株作為雜交親本，分離得到它們的單孢子，分別命名為V1～V10和T1～T10，進行兩兩雜交；通過0℃低溫處理篩選獲得耐低溫的雜交子，再利用交配型基因分子標記擴增來鑒定雜交子的真實性，最后通過低溫栽培出菇試驗對耐低溫雜交子進行了出菇農藝性狀的考察，初步獲得了耐低溫性良好且生物轉化率較高的草菇雜交菌株。
1 結果與分析
1.1 RAPD分析
利用8條引物對11個草菇樣本進行擴增，8條引物均能擴增出穩定性強、可重復性高且多態性豐富的條帶，每個引物擴增出的DNA條帶數從5到11不等，8條引物共擴增出54個RAPD位點，其中多態性位點有37個，多態性頻率為68.5%，說明草菇菌株間具有豐富的遺傳多樣性。
不同草菇菌株間的遺傳距離從0.0615到0.4680之間，其中菌株A8與3560遺傳距離最近，Vn-1和泰國No.1遺傳距離最遠，本試驗中親本菌株VH3和泰國No.1的遺傳距離為0.3180。使用NTSYSpc軟件對11個草菇菌株進行聚類分析，由聚類圖可知，在遺傳相似系數為0.65時，11個菌株被分成2大類，其中泰國No.1單獨聚為一類，其它10個草菇菌株聚為一類；在遺傳相似系數為0.722時，11個菌株又被分為3大類：泰國No.1單獨聚為一類，Vn-1、VH3、大菇托、V23、WG聚為一類，0229、Vn-3、3560、A8、托31聚為一類。當遺傳相似系數為0.91時，11個菌株都能夠被分開。作為親本菌株的VH3和泰國No.1在遺傳相似系數為0.65時被分開，說明兩者親緣關系較遠。
1.2 單孢菌株的交配型鑒定
對10個VH3單孢進行A1、A2交配型基因的擴增，結果顯示V1、V3、V4、V6只有A1條帶，V2、V5、V7～V10只有A2條帶。對10個泰國No.1單孢進行A3、A4交配型基因的擴增，結果顯示T5只有A4條帶，其余9株只有A3條帶。
1.3 耐低溫可能雜交菌株的篩選
對300株可能的草菇雜交子進行低溫篩選，與親本比較恢復生長速度的差異，發現有112株恢復速度快于親本，41株恢復速度與親本相當，另有147株恢復長勢較差或根本無法恢復生長。CK為對照菌株VH3，A、B、C分別代表恢復生長優、良、差的菌株。
1.4 雜交菌株真實性的鑒定
當菌株同時具有兩親本特異性交配型基因時，才能判斷該雜交子的真實性。將耐低溫的112株可能雜交子進行PCR擴增后，共得到77株真實雜交子。菌株1～10號為VH3的A1交配型和泰國No.1的A3交配型雜交后得到的雜交子的鑒定結果，1～10號都能擴增出兩親本對應的特異性交配型基因分子標記，表明這10個菌株都是真實的雜交子。
1.5 耐低溫雜交菌株出菇情況
出菇的14株雜交子中有10株在生物轉化率上具有超親優勢，其中V6T3-1、V10T4-3、V9T3-1、V4T9-2的平均生物轉化率大于20%，遠高于兩親本。雜交子的原基出現時間和采收時間各不相同，其中V6T3-1原基出現時間平均為6d，遠短于兩親本，超親優勢明顯。綜合來看，V6T3-1不僅在現原基及采收時間上相對于親本有明顯優勢，而且生物轉化率達到28.26%，是具有潛在應用價值的優良菌株。將V6T3-1子實體提取全基因組DNA，再次利用交配型基因分子標記進行雜合子真實性鑒定，結果證明其為真實的雜交子。
2 討論
本試驗采用RAPD方法對11個草菇菌株進行遺傳差異分析，其中泰國No.1與其它的10個菌株遺傳距離較遠，平均遺傳相似系數為0.678，余志晟等(2005)利用RFLP和RAPD方法對國內12個草菇菌株進行分析，發現菌株間的平均遺傳相似系數為0.707，韋仕巖等(2013)對17個草菇菌株進行ISSR遺傳差異分析，所得到的相似度平均值為0.73，均高于本試驗中的數值，說明泰國No.1作為外來菌株在遺傳背景上與其它10株國內菌株遺傳距離要遠。食用菌育種的方法主要有雜交育種、原生質體融合育種、誘變育種、基因工程育種等，雜交育種因其操作簡單，可預見性強而被廣泛使用。在草菇全基因組測序的基礎上，本研究應用新開發的特異性引物A1F/A1R、A2F/A2R對VH3的單孢進行鑒定，運用特異性引物A3F/A3R、A4F/A4R對泰國No.1的單孢進行鑒定，成功鑒定出草菇單孢的交配型類型。單孢雜交配對后，按照A1A3、A1A4、A2A3、A2A4進行鑒定。為了減少雜交子栽培出菇的工作量，先利用低溫處理進行初步篩選，運用陳明杰等(2013)“快速篩選耐低溫草菇菌種的方法”，本試驗中300株可能的草菇雜交子經過低溫篩選剩余112株可能的耐低溫雜交子，大大減少了后續的工作量。將篩選出的112株可能的雜交子進行交配型基因鑒定后得到77株真正的雜交子，比例達到68.75%。由此可以看出，在出菇試驗之前進行耐低溫菌株的篩選和雜交子真實性的鑒定，減少了出菇的工作量和能源消耗，大幅度提高了草菇新品種選育的效率。
本研究的出發菌株VH3是一個相對耐低溫的草菇菌株，選取與其親緣關系較遠的泰國No.1菌株與之雜交，以期獲得低溫高產的草菇新菌株。出菇試驗結果顯示，V6T3-1、V10T4-32個菌株原基出現時間、采收時間均早于兩親本，生物轉化率分別為28.26%和22.30%，均高于兩親本。其中V6T3-1不僅采收時間短于親本，且單筐產量高、菇型好，可在草菇主產區進行小范圍試種，驗證其產量和農藝性狀的穩定性。
3 材料與方法
3.1 試驗材料
草菇菌株VH3、泰國No.1、Vn-1、0229、大菇托、V23、3560、A8、WG、Vn-3和托31，由上海市農業科學院食用菌研究所提供。VS-15000CFNⅡ高速冷凍離心機、手動移液器購自德國Eppendorf股份公司；HWS12型電熱恒溫水浴鍋購自上海一恒科學儀器有限公司；ABI9700型PCR擴增儀購自AppliedBiosystems公司；JY600+型電泳儀購自Bio-Rad公司；EC3ImagingSystem凝膠成像系統購自SYNGENE公司。瓊脂粉購自基因科技(上海)有限公司；TaKaRaExTaqKit購自寶生物工程(大連)有限公司；D2000DNALadder購自天根生化科技(北京)有限公司。
PDA培養基、PDY培養基為常用培養基。栽培培養基：棉籽殼95%，生石灰5%，相對濕度65%。
3.2 遺傳多樣性分析
用改進的CTAB法(張紅等,2006)提取草菇菌株VH3、泰國No.1、Vn-1、0229、大菇托、V23、3560、A8、WG、Vn-3、托31的全基因組DNA。從35個隨機引物中挑選了8個擴增效果及穩定性好的引物對11個草菇菌株進行擴增。PCR擴增程序為：94℃3min；94℃1min，38℃1min，72℃2min，35個循環；72℃10min。RAPD-PCR產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，然后用凝膠成像系統照相。使用NTSYSpc軟件對數據進行處理，構建遺傳相似系數聚類圖譜。
3.3 親本單孢菌株的獲取
用孢子收集器收集VH3、泰國No.1的孢子，采用平板稀釋涂布法分離單孢菌株，然后將收集的單孢菌株接到PDA斜面上，于15℃保藏備用。
3.4 菌株的活化與擴大培養
將保藏的VH3和泰國No.1的單孢菌株轉接到新的PDA斜面中，放置于32℃培養箱中培養3～5d，然后挑取新長出的菌絲轉接到新的斜面上，如此重復2～3次。
3.5 單孢菌株的交配型鑒定
將活化后的菌株接入PDY培養基，搖瓶培養2～3d后收集菌絲，冷凍干燥后用改進的CTAB法提取草菇單孢菌株的全基因組DNA。根據草菇交配型A位點的特異性分子標記來設計引物，進行PCR擴增，其中VH3單孢交配型定為A1、A2，泰國No.1單孢交配型定為A3、A4。
3.6 單孢雜交
將已經鑒定交配型的VH3和泰國No.1單孢菌株各10株，兩兩接到PDA平板上，相距1cm，放到32℃培養箱中恒溫培養，待兩個菌落連接后，分別從兩個菌落連接處和兩側挑取菌塊，100種配對組合共有300個可能的雜交子，轉接到PDA斜面中，在32℃下培養。為避免因挑取的菌塊是由兩種單孢菌絲扭結在一起而對后續的鑒定產生影響，挑取菌絲尖端部分進行分離純化(傅俊生等,2010b)。
3.7 耐低溫雜交菌株的篩選
挑取菌塊正面朝上接到PDA平板培養基中，放入32℃恒溫培養箱培養1～2d，待菌絲長出后沿菌絲生長外緣劃線，然后放入0℃處理10h。將低溫處理過的平板放回32℃恢復生長3d，觀察并記錄菌絲恢復生長情況，同時用親本中耐低溫的VH3菌株作為對照，恢復生長速度比VH3快的菌株視為耐低溫菌株。
3.8 雜交菌株的鑒定
篩選出的耐低溫菌株可能是VH3或泰國No.1菌株的單孢菌株，而不是真正的雜交子，故還需要進一步的分子驗證。對獲得的可能雜交菌株按照交配型A1A3、A1A4、A2A3、A2A4進行PCR擴增，雜交成功的菌株能同時擴增出具有雙親的兩條條帶，而未雜交成功的單孢菌株只能擴增出一條條帶，即可篩選出真正的雜合子。
3.9 雜交子的低溫出菇
選取14株菌絲生長旺盛的雜交子，連同兩個親本同時進行28℃低溫出菇試驗，每個菌株設置3個平行，按照常規管理方法進行出菇試驗，以期篩選出低溫高產的草菇雜交新菌株。
