固態菌種生產技術操作規程

　　菌種是食用菌生產的基礎，只有優良的菌種才可能有好的收成。菌種一般分為母種、原種或栽培種3級。無論制作哪一級菌種，關鍵應強調無菌觀念，嚴格按照無菌技術要求進行操作。固態菌種生產技術操作規程如下：

　　1、范圍

　　本標準規定了食用菌菌種的定義、操作規程、菌種質量標準以及標志、貯存、運輸。本標準適用于各種食用菌母種、原種、栽培種。

　　2、引用標準

　　下列標準所包含的條文，通過在本標準中引用而構成為本標準的條文。本標準出版時，所示版本均為有效，所有標準都會被修訂，使用本標準的各方應探討使用下列標準最新版本的可能性。

　　GB/T 12728-91　食用菌術語

　　DB33.B39.063-90　食、藥用菌菌種質量標準

　　
　　3、定義

　　3.1　母種（一級菌種，俗稱試管菌種）　由孢子、子實體組織、耳木或基質菌絲分離純化，并在瓊脂培養基上繁殖的菌種。

　　3.2　原種（二級菌種）　由母種移植到固體培養基繁殖的菌種。

　　3.3　栽培種（三級菌種，俗稱生產種）　由原種移植擴大的菌種。

　　3.4　培養基　培養物生長所需營養物質的液體或固體混合物。

　　3.5　移植　將菌種從一種基物移接到另外的培養物中擴大培養的過程。

　　3.6　接種　將菌種移植在培養基物中的方法。

　　3.7　無菌　不含活雜菌體的狀態。

　　4、菌種操作規程

　　4.1　母種操作規程

　　母種的制作大致經過以下幾個過程：培養基配制→培養基滅菌→子實體分離或耳木分離或孢子分離→培養→轉管純化培養→母種。

　　4.1.1　培養基制作　

　　根據不同食用菌的不同營養需要配制不同的培養基。常用的配方有：

　　①、土豆葡萄糖瓊脂培養基(簡稱PDA培養基)　土豆(即馬鈴薯)200克、葡萄糖20克、瓊脂(凝固劑)20克。

　　②、土豆蔗糖瓊脂培養基(PSA培養基)　土豆200克、瓊脂20克、蔗糖20克、水1000毫升。

　　③、土豆胡蘿卜瓊脂培養基(PCA培養基)　土豆20克、胡蘿卜25克、瓊脂20克、水1000毫升。

　　④、土豆瓊脂培養基(PA培養基)　土豆250—300克、瓊脂20克、水1000毫升。　

　　4.1.2　容器　試管，試管應保持清潔、干燥、無菌。

　　4.1.3　滅菌

　　因為自然界里到處有微生物的存在，如空氣、所有原料、水以及一切用具和器具的表面，這些微生物對食用菌菌種而言，都屬于有害菌，即通常所說的雜菌。我們制作的菌種，要求絕對不能染上雜菌，所以必須進行嚴格滅菌。常用滅菌方法有：

　　①、高壓蒸氣滅菌　即用高壓滅菌鍋，通過加熱增加鍋內壓力，使蒸氣溫度升高到120℃以上，在短時間內殺死一切微生物和它們的芽抱及抱子。原種用量較栽培種少，一般小批量生產使用這種滅菌方法，滅菌時間在1.5公斤/平方厘米的壓力下，維持在0.5～1小時。

　　②、加熱滅菌法　近年來普遍使用的一種方法是常壓一次滅菌法，所需設備簡單、投資少、成本低，適合我國農村使用。此法只要砌一個鍋灶，買一口大鍋，做幾個蒸籠就可以了。把待殺菌的物品放入蒸籠里，從上氣開始，保持蒸煮6～8小時，即可達到滅菌的目的。

　　③、紫外線滅菌法　開紫外燈30～40分鐘，基本上可達殺菌目的，距照射物的距離以不超過1.2米為宜。注意紫外線對人體有傷害作用，所以不能用眼睛直視開著的紫外線燈，也不能開著燈工作。

　　4.1.4　母種分離

　　即通常將食用菌的子實體、土壤中的菌根、菌素分離或進行耳木分離或孢子分離，然后在培養基上培養，得到母種。作為分離母種的種菇、種耳，必須從高產、穩產、適應性強的優良品系群體中，通過挑選、對照、評審，然后擇優選取個體健壯，朵形圓正，外表清潔，無病蟲害的種菇或種耳，作為分離的母體。具休分離方法有以下幾種：

　　①、孢子彈射法　分離前把子實體用無菌水沖數遍后，用濾紙吸干表面水分。然后在接種箱或無菌室內。把種菇的菌褶朝下，用不銹鋼絲勾住，懸掛在二角瓶內培養基的上方。勿使接觸到培養基或四周瓶壁。瓶口用棉花塞緊。置于該菌適宜的溫度下培養。一般12～20小時，菌褶上的孢子就會散落在培養基上，形成一層白色或其他顏色的粉未狀孢子印。香菇、金針菇、銀耳的孢子為白色，平菇極淡紫色，蘑菇、草菇為褐色。然后用無菌接種針沾取少量的孢子，在試管中的瓊脂斜面培養基上接種待孢子萌發，生成菌落時，選孢子萌發早，長勢好的菌落進行轉管培養即得母種。

　　②、組織分離法　食用菌子實體，實質就是一團分化了的菌絲體，所以可從子實體中切取一小塊放在培養基上培育，就可獲得母種。這種分離法屬于無性繁殖。具體操作：把經過篩選的優良品系的菇、耳子實體的組織塊，作為分離材料。淋雨或吸水的種菇、種耳容易污染菌，一般不能作為分離材料。分離時，把種耳撕開，在菌蓋和菌柄交界處或菌褶處，切取一小塊組織作為接種物。銀耳可以取耳片一點即可。為了減少帶雜菌的機會，切取組織塊時，應盡量小些，可得到的純度高的菌種。然后接到斜面試管培養基的中央，在適宜的溫度下培養，當組織塊上長出菌絲，并向培養基上蔓延生長時，選擇健壯、優良的菌絲體，移植到新的培養基上，進行擴大培養，即成為母種。

　　③、基內分離法　就是利用食用菌生育的基質作為分離材料，來得到菌絲體的一種方法。過去多用菇木或耳木的表面經過無菌處理，在該菌菌絲分布處切取接種塊進行培養。近年來，銀耳等均采用室內袋栽法。基內分離也就可以從栽培袋中挑選優良品系，割去子實體。取耳基作為分離材料。為了獲得純菌絲，先在袋內培養基的前端，挑取香灰菌絲少許，接入試管內培養。然后利用銀耳菌絲和香灰菌絲的抗旱能力不同的特征，把分離材料進行風干或“迫干”脫水，然后剝取耳座內菌絲團，從中挑取灰白色粉狀的菌絲體培養，得到純白菌絲，再與香灰菌絲交合培養，即得母種。

　　無論采用那一種分離法，接種后都應當把試管放在抱子萌發或菌絲生育的最適溫度下培養。一般培養7～10天就可以看到芒狀的菌絲，經過鑒別，如無雜菌，所得的菌絲即為純菌種。

　　4.1.5　母種轉管擴大培養

　　用上述方法得到的母種數量有限，往往不能滿足生產上的需要，因而需要通過接種來擴繁一批母種供生產用。當分離的純菌種轉管接種后菌絲已基本布滿斜面時，即可進行母種的轉管擴大培養。選擇菌絲健壯、生長旺盛無老化、無感染雜菌的母種試管，在接種箱內，用接種刀把試管內的菌絲體連同培養基切成2×3毫米的小塊，隨即接入若干支的試管培養基中央，塞緊棉塞。接種完畢后，將試管放于恒溫箱內培養。一般每支母種試管可擴大繁殖30～40新管。

　　轉管接種操作要在嚴格的無菌條件下進行。其無菌操作要點如下：

　　①、將接種用母種試管和接種用試管夾在左手的母指和其他四指間。

　　②、右手拿接種刀，將接種刀置于酒精燈火焰內灼燒后，冷卻1～2分鐘。

　　③、將兩支試管的棉塞用右手小指、無名指、中指夾住，慢慢拔下。然后將試管管口進行火焰滅菌并放在火焰無菌區內(一般在火焰上方3厘米和火焰周圍1厘米范圍內)。試管要與操作臺面平行并稍向下傾斜。

　　④、將接種刀放入菌種試管內，把培養基分割成2毫米×3毫米小塊，然后換用接種鏟(灼燒，冷卻)，輕輕挑敢一小塊菌種，馬上抽出移入另一待接種的試管斜面培養基中央貼放好。

　　⑤、將試管口與棉塞輕輕進行火焰滅菌后，迅速把棉塞塞進試管。
保藏的菌種在使用前，需先將菌種置于適溫下，讓其活化，然后及時使用轉管，否則不易成活。轉管應采用同一配方的培養基，可以收到較好的效果。

　　4.2　原種操作規程

　　原種也叫二級菌種，是由母種接種到瓶子或塑料袋里，經培養后得到的菌種。制作原種的目的，一是為了擴大種量，滿足生產上的需要；二是讓菌絲對各種秸稈類物質具有適應能力，并在適應的同時產生各種酶類；三是在培養過程中還可以對菌種的生命力、純度等進行檢驗，存優棄劣。通過接種，一支母種可擴接3～5瓶原種。常見原種培養基配方：

　　4.2.1　培養基制作

　　①、鋸末培養基：鋸末(闊葉樹)78％、米糖(或麥麩)20％、糖(紅糖或白糖，下同)1％、石膏粉1％，水適量。

　　②、棉子殼培養基：棉子殼78％、麥麩或米糠20％、石膏粉1％、糖1％，水適量。

　　③、鋸末玉米粉培養基；鋸末(闊葉樹)90％、玉米粉8％、糖1％、石膏粉1％，水適量。

　　④、稻草段培養基：稻草段78％、米糠或麩皮20％、石膏粉1％、糖1％。

　　⑤、鋸末、棉子殼混合培養基：鋸末40％、棉子殼40％、麥麩18％、石膏粉1％、糖1％，水適量。

　　⑥、酒糟培養基：干酒糟40％、棉子殼(或鋸末)40％、麥麩18％、石灰1％、糖1％，水適量。
　　4.2.2　容器

　　采用750ml的常規玻璃菌種瓶，玻璃瓶應保持清潔、干燥、無菌。

　　4.2.3　裝料

　　裝料時要隨加隨壓實，松緊適度，上下均勻一致，四周無空隙，瓶肩裝結實，一般裝到瓶肩為宜（約350g），料裝好后，用錐形木棒在瓶中央打一洞或用手指在中央摁一小洞穴，然后塞上棉塞，瓶口無空隙，松緊、高度適當，以單獨提瓶瓶不掉下，棉塞碰不到料面為準。

　　4.2.4　滅菌

　　同4.1.3。

　　4.2.5　接種

　　滅菌后的料瓶放在干燥清潔，且通風條件好的室內冷卻至10℃以下，放入接種箱內，用甲醛、高錳酸鉀將料瓶外壁作殺菌處理。接種時，用接種鏟將母種菌絲連同培養基切成25×200mm小段，每一小段接3～4瓶，接植于料瓶洞口，塞上棉塞。

　　4.2.6　培養

　　將接種后的菌種瓶立即放入溫度控制在20～25℃、相對濕度70%左右的培養室內培養。在發菌培養階段，菌種瓶必須豎放，待菌種萌發吃料后，可臥倒疊放，培養7～10天后檢查有無雜菌；及時剔除，在整個培養過程中檢查2～3次，直到菌絲長到瓶底，備用。

　　4.3　栽培種操作規程

　　4.3.1　培養基制作　同4.1.1。

　　4.3.2　容器

　　采用750ml的常規玻璃菌種瓶，水果罐頭瓶，低壓聚乙烯或聚丙烯塑料袋等。

　　4.3.3　裝料

　　同4.2.3。

　　4.3.4　滅菌

　　同4.1.3。

　　4.3.5　接種

　　選擇菌絲色白、生長有力、清晰、無雜菌的原種作為接種材料。接種時敲掉原種瓶底，用鑷子夾取少量菌絲塊，接在培養基洞口，每瓶原種接50～60瓶栽培種，離瓶口3～4cm處的砂厚種棄之不用。

　　4.2.6　培養

　　接種后菌種瓶整齊排放在干燥清潔的培養室內，溫度一般控制在20～25℃，相對濕度為70%左右。5～7天后檢查有無雜菌，之后每隔15天左右檢查一次，直至菌絲長到瓶底，備用。

　　5、菌種質量標準

　　5.1　外觀

　　菌絲呈白色或灰白色，有線條狀菌束，伸展整齊、健壯，不徒長，不結塊，瓶肩處不退菌，瓶底不吐黃水，瓶口棉塞完整，不松動、不脫落。

　　5.2　氣味

　　有鮮菇味，無其他異味。

　　5.3　菌絲狀態

　　菌絲生長應均勻一致，無斷裂、無萎縮及明顯的菌絲退化現象，不應有黃斑狀的菌絲或吐黃水現象或銹色水滴，搖動時無松動狀，手感潮濕。

　　5.4　雜菌、害蟲

　　菌種應無雜菌污染、無害蟲滋生。

　　5.5　適宜的菌齡

　　栽培種菌齡一般75～100天（自接種到下種），時間過長會出現菌絲退化、吐黃水等現象。

　　5.6　重量適當

　　750ml的玻璃菌種瓶一般800～850克，過重則表明料太濕或裝料偏緊，過輕則表明料偏干或裝料過松，均不利菌絲生長。

　　6、標志、貯存、運輸

　　6.1　標志

　　出售的菌種必須貼有菌種質量合格標簽，注明菌種種類、級別、品種、生產單位、接種日期。

　　6.2　貯存

　　6.2.1　母種保存方法

　　可把試管放在室溫15℃的室內保存，冬季應移入恒溫箱內，防止受凍。此法適于草菇、銀耳等在夏、秋季節生產的高溫菌類。而香菇、平菇、蘑菇、樸菇、黑木耳等秋冬季節生產的菌種，可置于0～7℃的冰箱中保存。也可把試管口用臘封好后，再包上塑料薄膜，沉在清涼的井底保存。低溫保存、每隔3～5個月就應轉管移接一次，在適宜的溫度下培養一星期，待菌絲基本布滿斜面后，再放在低溫中保存。

　　6.2.2　原種保存方法

　　原種連同菌種瓶用牛皮紙包好，放在4～14℃的溫度下可保存工年左右。

　　6.2.3　栽培種保存方法

　　栽培種因運輸、氣候等原因，一時用不定，可暫時放在陰涼、干燥、通風、陰暗的室內保存。

　　6.3　運輸

　　各級菌種不得在氣溫30℃運輸，在運輸中需要防震、防潮、防曬、防污染措施。

　　附：

　食用菌衛生管理辦法(衛生部)

　　第一條　為貫徹預防為主的方針和執行《中華人民共和國食品衛生法(試行)》，加強食品衛生管理，提高食用菌的衛生質量，保障人民身體健康，特制訂本辦法。

　　第二條　本辦法管理范圍系指蘑菇、香菇、草菇、木耳、銀耳、雞(土從)、猴頭等鮮、干食用菌及其制品。

　　第三條　為防治病蟲害，使用藥物消毒殺蟲時，僅能用于菇房,并應嚴格掌握用量，　嚴禁使用1605、1059、666、DDT、汞制劑、砷制劑等高殘毒或劇毒農藥。

　　第四條　栽培食用菌使用的材料，應報請當地食品衛生監督部門審查，符合衛生要求，方能生產、銷售。

　　第五條　食用菌制品，使用添加劑應符合現行的《食品添加劑使用衛生標準》。原料用水應符合現行的《生活飲用水衛生標準》。

　　第六條　食用菌生產購銷部門，必須加強毒菌、食菌鑒別知識的宣傳，建立質量檢驗制度，對食用菌要做到專人負責，分類收購，嚴格檢查，防止毒菌混入，嚴禁摻假、摻雜。

　　第七條　食用菌的包裝、貯存、運輸必須符合衛生要求，嚴禁使用裝過農藥、化肥及具他有毒物質的容器包裝，嚴禁與農藥、化肥、中草藥材和其他雜物混堆、混運。

　　第八條　為了加強食品衛生管理，食品衛生監督機構可以向生產、銷售等單位，根據需要按手續無償采取樣品檢驗，并給予正式收據。